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你分離的細胞外囊泡,真的幹淨嗎?
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發布時間:2019-06-28 13:51:56
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      在細胞外囊泡(EV)的分離實驗中,來源於血清血漿的細胞外囊泡的分離純化是比較棘手的,原因是血液樣本的的成分比較複雜,很容易造成細胞外囊泡的汙染,血清血漿中的脂蛋白顆粒就是細胞外囊泡難以分離的汙染物之一。

      細胞外囊泡(EV)和脂蛋白顆粒都是血液循環係統中的納米顆粒,執行著許多生物學功能:


脂蛋白:是血液中膽固醇的載體,可以運載膽固醇到各種細胞或組織,滿足各個組織細胞對膽固醇的需要。按照密度分類:低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、極低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)。


細胞外囊泡從細胞膜上脫落,由細胞分泌而成的,具有磷脂雙分子層的膜性囊泡。可以攜帶生物活性物質(蛋白質、脂質、核酸等),轉遞到受體細胞,參與細胞間通訊。




▲細胞外囊泡與脂蛋白的體積、密度比較圖

外泌體與脂蛋白的體積和密度如此相近,以至於很多傳統的方法都不能夠把他們完全分離。

1.密度梯度超速離心:高密度脂蛋白(HDL)的密度最與細胞外囊泡相近,所以它是密度梯度離心最主要的汙染脂蛋白。低密度脂蛋白(LDL)雖然密度略低於細胞外囊泡(EV),但密度梯度離心的方法不足以完全的把他們分開,而且低密度脂蛋白在血漿含量特別多(約1015次冪particles/mL),細胞外囊泡在血漿含量(1010次冪particles/mL左右)。在低密度脂蛋白如此大的數量基數下,密度相差不大的細胞外囊泡和低密度脂蛋白,很難用密度梯度離心完全分離。


2.分子排阻法(SEC):分子排阻法分離細胞外囊泡的原理是利用了細胞外囊泡與其他雜質的粒徑大小,由上圖可以看出分子排阻法也不能夠完全從血漿的細胞外囊泡中分離開低密度脂蛋白(LDL)和極低密度脂蛋白(VLDL)。


3.超速離心法:所謂的"金標準"—超速離心也容易引起脂蛋白的汙染,因為在恒定加速度下,球形物體的沉降速率與顆粒密度和介質密度之差以及顆粒粒徑的平方成正比。也就是說,介質和轉數恒定,在粒徑和密度相差不大的情況下,顆粒的沉降速率也相差不大,更何況脂蛋白的顆粒數高於外泌體數萬倍,在如此高的數量基數下,超速離心是不能夠完全分離純淨的外泌體的。

文獻來源: What Are We Looking At? Extracellular Vesicles, Lipoproteins, or Both?  2017



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